摘要▼

分子诊断技术的发展加速推进了儿童感染性疾病病原体核酸检测向高通量、高灵敏度、自动化发展的进程。在临床常用的荧光定量PCR技术之外，多重PCR技术、数字PCR技术、等温扩增技术、微流控芯片的应用使病原体核酸检测在通量和灵敏度上有了显著提升，这些技术配合一体机的使用实现了儿童感染性疾病病原体核酸检测的自动化和高通量化。高通量测序技术可以最大程度获取标本中几乎所有病原体的核酸信息，已逐渐成为临床感染性疾病诊断的重要辅助手段。

由于儿童免疫系统发育尚未完善，感染性疾病成为儿童最为常见的疾病，年全球有3.26亿5岁以下儿童死于感染性疾病，占所有5岁以下儿童死亡数的50%以上。病原微生物的早期、快速、准确诊断在感染性疾病的诊断、治疗和预防中起着至关重要的作用。随着近年来分子诊断技术的不断创新，感染性疾病病原体核酸检测技术也取得了快速发展和广泛应用。

一、儿童临床病原体核酸检测现状及挑战

儿童感染性疾病具有病原微生物多样性、复杂性、载量低等特点。目前，病原学核酸检测主要依赖于PCR技术，尤以荧光定量PCR技术的应用最为广泛。荧光定量PCR技术因其实时定量、闭管检测、特异性强等优点，被广泛应用于细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体和病原体耐药基因等临床病原学核酸检测领域。但该技术也存在通量过低、检测灵敏度有限等缺点，不适用于临床多种病原体的同时检测以及特殊低载量病原体样本的检测。同时，国内各级医疗机构感染性PCR实验室自动化程度不高，也限制了该技术进一步的临床应用。自动化、高通量、高灵敏度必然是未来儿童感染性疾病核酸检测的发展方向。

二、儿童病原体核酸检测技术的发展及临床应用

（一）基于PCR技术的病原体核酸检测

为了克服荧光定量PCR技术通量低、灵敏度有限的缺点，目前新开发的临床常见病原体核酸检测技术主要包括多重PCR技术和数字PCR技术。

1．多重PCR技术：

主要应用多重引物，针对不同的病原体核酸或耐药基因进行特异性扩增，根据不同病原体扩增产物的长度差异来判断何种病原体感染，也可以同时检测同一样本中的细菌、病毒、支原体等临床常见病原体及其耐药基因。该技术早期主要通过凝胶电泳和毛细管电泳人工来判断结果，如黄烈等建立了多重PCR技术同时检测流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等9种儿童常见的呼吸道病毒，最终通过凝胶电泳分析PCR产物大小来判断病毒类型；张海邻等建立了同时检测病毒、衣原体等11种儿童常见呼吸道感染病原微生物的多重PCR体系，检测结果通过毛细管电泳法进行分析。但该技术存在扩增产物易污染的缺点。近几年一些企业已将PCR扩增和毛细管电泳做成一体机用于儿童感染性疾病的病原学检测，封闭检测降低了核酸污染机率，并通过机器判读结果，减少了检验人员的操作误差和工作量。一体机使PCR技术摆脱了场地和荧光定量PCR仪的限制，更适合门诊或基层儿童感染性疾病病原学核酸检测的快速普及。

2．数字PCR技术：

包含列阵数字PCR、磁珠乳液扩增方法（beads，emulsion，amplification，andmagnetics，BEAMing）数字PCR和微滴数字PCR。其中微滴数字PCR应用最为广泛，该系统要求在传统PCR扩增前把测试样本分割为成千上万的水包油微滴，分割后每个微滴成为1个独立的PCR反应体系，可以实现病原微生物的绝对定量，将PCR灵敏度提升了10~倍。在儿科感染领域，微滴数字PCR主要应用于细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原微生物的精准定量检测，如结核杆菌、HBV、HIV和疟原虫等，进而指导临床诊断和治疗[10,11,12]。

（二）基于等温扩增技术的病原体核酸检测

等温扩增技术可以实现恒定温度下扩增目标核酸片段，不仅避免了PCR反应的升、降温过程，缩短了扩增时间，而且摆脱了PCR仪的限制，能医院。依据等温扩增酶及引物设计的特性，等温扩增技术主要包括环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）、实时荧光核酸恒温扩增（simultaneousamplificationandtesting，SAT）、酶促重组等温扩增（EnzymaticRe

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